Gene-klonen is de handeling van het maken van kopieën of klonen van een enkel gen. Zodra een gen is geïdentificeerd, kunnen klonen worden gebruikt in veel gebieden van biomedisch en industrieel onderzoek. Genetische manipulatie is het proces van het klonen van genen in nieuwe organismen of het veranderen van de DNA-sequentie om het eiwitproduct te veranderen. Genetische manipulatie hangt af van ons vermogen om de volgende essentiële procedures uit te voeren.
01 Polymerase kettingreactie
02 Beperkende enzymen
De ontdekking van enzymen die bekend staan als restrictie-endonucleasen is essentieel geweest voor eiwit-engineering . Deze enzymen snijden DNA op specifieke locaties op basis van de nucleotidesequentie. Honderden verschillende restrictie-enzymen , in staat om DNA op een verschillende plaats te knippen, zijn geïsoleerd uit vele verschillende stammen van bacteriën. DNA dat is gesneden met een restrictie-enzym produceert veel kleinere fragmenten van verschillende grootten. Deze kunnen worden gescheiden met behulp van gelelektroforese of chromatografie.
03 Elektroforese
Zuiveren van DNA uit een celkweek of knippen met restrictie-enzymen zou niet veel van nut zijn als we het DNA niet zouden kunnen visualiseren - dat wil zeggen, een manier vinden om te bekijken of je extract iets bevat of welke maat je fragmenteert heb het gesneden. Een manier om dit te doen is door gelelektroforese. Gels worden voor verschillende doeleinden gebruikt, van het bekijken van gesneden DNA tot het detecteren van DNA-inserts en knockouts.
04 Verbind twee stukken DNA
Bij genetisch onderzoek is het vaak nodig om twee of meer individuele DNA-strengen te verbinden, om een recombinante streng te maken, of een ronde streng te sluiten die is gesneden met restrictie-enzymen. Enzymen die DNA-ligasen worden genoemd, kunnen covalente bindingen creëren tussen nucleotide-ketens. De enzymen DNA-polymerase I en polynucleotide-kinase zijn ook belangrijk in dit proces, voor het opvullen van openingen of het fosforyleren van de 5'-uiteinden respectievelijk.
05 Selectie van klein zelf-replicerend DNA
Kleine ronde stukjes DNA die geen deel uitmaken van een bacterieel genoom, maar in staat zijn tot zelfreplicatie, staan bekend als plasmiden. Plasmiden worden vaak gebruikt als vectoren om genen tussen micro-organismen te transporteren. In de biotechnologie, als het gen van belang eenmaal is geamplificeerd en zowel het gen als het plasmide zijn geknipt door restrictie-enzymen, worden ze samen geligeerd waardoor een zogenaamd recombinant DNA wordt gegenereerd. Virale (bacteriofaag) DNA kan ook als een vector worden gebruikt, evenals cosmiden, recombinante plasmiden die bacteriofage genen bevatten.
06 Methode om een vector naar een gastheercel te verplaatsen
Het proces van overdracht van genetisch materiaal op een vector zoals een plasmide, in nieuwe gastheercellen, wordt transformatie genoemd. Deze techniek vereist dat de gastheercellen worden blootgesteld aan een omgevingsverandering waardoor ze "competent" of tijdelijk doorlatend voor de vector worden. Elektroporatie is zo'n techniek. Hoe groter het plasmide, hoe lager de efficiëntie waarmee het door cellen wordt opgenomen. Grotere DNA-segmenten kunnen gemakkelijker worden gekloond met behulp van bacteriofaag, retrovirus of andere virale vectoren of cosmiden in een methode die transductie wordt genoemd. Fagen of virale vectoren worden vaak gebruikt in de regeneratieve geneeskunde, maar kunnen de insertie van DNA in delen van onze chromosomen veroorzaken waar we het niet willen, wat complicaties en zelfs kanker veroorzaakt.
07 Methoden om transgene organismen te selecteren
Niet alle cellen zullen DNA opnemen tijdens transformatie. Het is essentieel dat er een methode is om degenen die dat wel doen te detecteren. In het algemeen dragen plasmiden genen voor antibioticumresistentie en transgene cellen kunnen worden geselecteerd op basis van expressie van die genen en hun vermogen om te groeien op media die dat antibioticum bevatten. Alternatieve selectiewerkwijzen hangen af van de aanwezigheid van andere reportereiwitten zoals het x-gal / lacZ- systeem of groene fluorescentie-eiwit, die selectie op basis van respectievelijk kleur en fluorescentie mogelijk maken.