Het PCR-proces werd in 1983 ontwikkeld en heeft het mogelijk gemaakt DNA-sequencing uit te voeren en de volgorde van nucleotiden in individuele genen te identificeren.
De methode maakt gebruik van thermische cycli of het herhaaldelijk verwarmen en afkoelen van de reactie voor DNA-smelten en replicatie. Terwijl PCR doorgaat, wordt het "nieuwe" DNA gebruikt als een matrijs voor replicatie en een kettingreactie volgt, exponentieel het DNA-sjabloon amplificerend.
PCR-technieken worden toegepast op vele gebieden van de biotechnologie, waaronder eiwittechnologie , klonen, forensisch onderzoek (DNA-vingerafdrukken), vaderschapstesten, de diagnose van erfelijke en / of infectieziekten en voor de analyse van milieumonsters.
Met name in de forensische geneeskunde is PCR vooral nuttig omdat het zelfs de kleinste hoeveelheid DNA-gegevens versterkt. PCR kan ook worden gebruikt om DNA te analyseren dat duizenden jaren oud is, en deze technieken zijn gebruikt om alles te identificeren, van een 800.000 jaar oude mammoet tot mummies van over de hele wereld.
PCR-procedure is als volgt:
- Initialisatie: deze stap is alleen nodig voor DNA-polymerasen waarvoor PCR met hot-start vereist is. De reactie wordt verwarmd tot tussen 94 en 96 ° C en gedurende 1-9 minuten gehandhaafd.
- Denaturatie: als de procedure niet geïnitialiseerd hoeft te worden, is denaturatie de eerste stap. De reactie wordt gedurende 20-30 seconden tot 94-98 ° C verwarmd. De waterstofbruggen van de DNA-matrijs zijn verstoord en er zijn enkelstrengs DNA-moleculen gemaakt.
- Gloeien: de reactietemperatuur is lager tot tussen 50 en 65 ° C en wordt 20-40 seconden aangehouden. De primers versmelten met de enkelstrengs DNA-matrijs. De temperatuur is extreem belangrijk tijdens deze stap. Als het te warm is, bindt de primer mogelijk niet. Als het te koud is, kan de primer onvolmaakt binden. Een goede binding wordt gevormd wanneer de primersequentie nauw overeenkomt met de templaatsequentie.
- Verlenging / rek: de temperatuur tijdens deze stap varieert afhankelijk van het type polymerase. Het DNA-polymerase synthetiseert een volledig nieuwe DNA-streng.
- Eindrek: Deze stap wordt uitgevoerd bij 70-74 ° C gedurende 5-15 minuten na de laatste PCR-cyclus.
- Laatste wachtstand: deze stap is optioneel. De temperatuur wordt op 4-15 ° C gehouden en stript de reactie.
De procedure is verdeeld in drie fasen:
- Exponentiële versterking: tijdens elke cyclus wordt het product (het specifieke stuk DNA dat wordt gerepliceerd) verdubbeld.
- Leveling-off fase: als de DNA-polymerase activiteit verliest en reagentia verbruikt, vertraagt de reactie.
- Plateau: er wordt geen product meer verzameld.