Wat PCR te maken heeft met DNA-sequentiëring en amplificerende genen
De polymerasekettingreactie ( PCR ) is een moleculair genetische techniek voor het maken van meerdere kopieën van een gen en maakt ook deel uit van het gensequencingproces.
Hoe werkt de polymerasekettingreactie?
Gene-kopieën worden gemaakt met behulp van een DNA-monster en de technologie is goed genoeg om meerdere kopieën te maken van één enkele kopie van het gen in het monster. PCR-amplificatie van een gen om miljoenen kopieën te maken, maakt detectie en identificatie van gensequenties mogelijk met behulp van visuele technieken op basis van grootte en lading (+ of -) van het stuk DNA.
Onder gecontroleerde omstandigheden worden kleine DNA-segmenten gegenereerd door enzymen die bekend staan als DNA-polymerasen, die complementaire deoxynucleotiden (dNTP's) toevoegen aan een stuk DNA dat bekend staat als het 'sjabloon'. Zelfs kleinere stukjes DNA, "primers" genoemd, worden gebruikt als een startpunt voor het polymerase. Primers zijn kleine door de mens gemaakte stukjes DNA (oligomeren), meestal tussen de 15 en 30 nucleotiden lang. Ze zijn gemaakt door het kennen of raden van korte DNA-sequenties aan de uiteinden van het gen dat wordt geamplificeerd. Tijdens PCR wordt het DNA waarvan de sequentie wordt bepaald verwarmd en scheiden de dubbele strengen zich. Na afkoeling binden de primers aan de mal (genaamd uitgloeien) en creëren een plaats voor het begin van de polymerase.
De PCR-techniek
De polymerasekettingreactie (PCR) werd mogelijk gemaakt door de ontdekking van thermofielen en thermofiele polymerase-enzymen (enzymen die structurele integriteit en functionaliteit behouden na verwarming bij hoge temperaturen).
De stappen die betrokken zijn bij de PCR-techniek zijn als volgt:
- Er wordt een mengsel gemaakt met geoptimaliseerde concentraties van de DNA-matrijs, polymerase-enzym, primers en dNTP's. Het vermogen om het mengsel te verwarmen zonder het enzym te denatureren, maakt denaturering van de dubbele helix van DNA-monster bij temperaturen in het bereik van 94 graden Celsius mogelijk.
- Na denaturatie wordt het monster gekoeld tot een meer gematigd bereik, ongeveer 54 graden, hetgeen het annealen (binden) van de primers aan de enkelstrengige DNA-matrijzen vergemakkelijkt.
- In de derde stap van de cyclus wordt het monster opnieuw verwarmd tot 72 graden, de ideale temperatuur voor Taq DNA-polymerase, voor verlenging. Tijdens elongatie gebruikt DNA-polymerase de oorspronkelijke enkele DNA-streng als een matrijs om complementaire dNTP's aan de 3'-uiteinden van elke primer toe te voegen en een sectie van dubbelstrengig DNA in het gebied van het gen van belang te genereren.
- Primers die zijn versmolten met DNA-sequenties die geen exacte overeenkomst zijn, blijven niet bij 72 graden gehybridiseerd, waardoor de verlenging van het gen van belang wordt beperkt.
Dit proces van denaturering, versmelting en verlenging worden meerdere (30-40) keer herhaald, waardoor het aantal kopieën van het gewenste gen in het mengsel exponentieel toeneemt. Hoewel dit proces nogal vervelend zou zijn als het handmatig wordt uitgevoerd, kunnen monsters worden bereid en geïncubeerd in een programmeerbare Thermocycler, nu gebruikelijk in de meeste moleculaire laboratoria, en een volledige PCR-reactie kan binnen 3-4 uur worden uitgevoerd.
Elke denaturatiestap stopt het verlengingsproces van de vorige cyclus, waardoor de nieuwe DNA-streng wordt afgekapt en op ongeveer de grootte van het gewenste gen wordt gehouden.
De duur van de verlengingscyclus kan langer of korter worden gemaakt, afhankelijk van de grootte van het gen van belang, maar uiteindelijk, door herhaalde cycli van PCR, zal het merendeel van sjablonen worden beperkt tot de grootte van het gen van belang alleen, omdat ze zal zijn gegenereerd uit producten van beide primers.
Er zijn verschillende factoren voor succesvolle PCR die kunnen worden gemanipuleerd om de resultaten te verbeteren. De meest algemeen gebruikte methode om te testen op de aanwezigheid van PCR-product is agarosegelelektroforese . Die wordt gebruikt om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte en lading. De fragmenten worden vervolgens gevisualiseerd met behulp van kleurstoffen of radio-isotopen.
De evolutie
Sinds de ontdekking van PCR zijn DNA-polymerasen anders dan de originele Taq ontdekt. Sommige van deze hebben een betere "proofreading" -capaciteit of zijn stabieler bij hogere temperaturen, waardoor de specificiteit van PCR wordt verbeterd en fouten door het invoegen van de onjuiste dNTP worden verminderd.
Sommige variaties van PCR zijn ontworpen voor specifieke toepassingen en worden nu regelmatig gebruikt in moleculair genetische laboratoria. Sommige hiervan zijn Realtime PCR en Reverse-Transcriptase PCR. De ontdekking van PCR heeft ook geleid tot de ontwikkeling van DNA-sequencing, DNA-fingerprinting en andere moleculaire technieken.