Aanpassingen aan een van de componenten van een polymerasekettingreactie (PCR) -reactie kunnen de kwaliteit van de uitkomst beïnvloeden, hetzij door de opbrengst en kwaliteit van het product te verbeteren of te verminderen, hetzij door de specificiteit en gevoeligheid van de reactie te verbeteren. Parameters die het eindresultaat beïnvloeden, kunnen fysiek zijn (temperatuur, cyclustijden) of chemisch (dwz sjabloonconcentratie, type enzym dat wordt gebruikt). De volgende zijn verschillende sleutelfactoren die het succes van PCR beïnvloeden.
01 Schone laboratoriumomstandigheden
Omdat PCR in staat is om een enkel molecuul DNA te detecteren, is het belangrijk om de oorspronkelijke omstandigheden in het laboratorium te handhaven. Draag altijd verse handschoenen, gebruik steriel glaswerk, tubes en pipetpunten en steriele oplossingen en maak het werkgebied schoon voordat u begint te werken.
Neem altijd controlereacties op, zonder template-DNA en zonder enzym, om zeker te stellen dat de resultaten echt te danken zijn aan amplificatie van het juiste monster.
De meeste mensen zorgen ervoor dat hun eigen set oplossingen niet wordt gedeeld om het oplossen van problemen gemakkelijker te maken en aangewezen pipetten worden vaak alleen gereserveerd voor PCR. DNase en RNase-vrije PCR-buizen, aërosolbestendige pipetpunten en het werken in een zuurkast met UV-licht zijn ook manieren om problemen te minimaliseren.
02 Chemische componenten
- Heb 18 tot 24 bases
- Heb geen secundaire structuur (dwz haarspeldlussen)
- Zorg voor een gebalanceerde verdeling van G / C- en A / T-paren
- Zijn niet complementair aan elkaar aan de 3-voeteinden
- Hebben smelttemperaturen (Tm) van ongeveer 5-10 graden Celcius onder de gloeitemperatuur, die gewoonlijk tussen 55 en 65 graden Celsius ligt
De Tm voor beide primers moet ook vergelijkbaar zijn voor de beste resultaten.
03 Reactiemix: sjabloon en primers
Optimale primerconcentraties liggen tussen 0,1 en 0,6 micromol / L. De hoeveelheid template varieert afhankelijk van het type DNA (humaan, bacterieel, plasmide).
Met zeer kleine hoeveelheden sjabloon zijn er andere strategieën om de resultaten te verbeteren, zoals verhoogde cyclusnummers of gebruik van 'hot start'. Test altijd nieuwe primers met een positieve controlereactie, om er zeker van te zijn dat ze werken onder uw specifieke experimentele omstandigheden.
04 Reactiemix: enzymactiviteit
De concentratie van MgCl2 in de reactiemengeling kan de PCR-uitkomst beïnvloeden en zou een belangrijke rol kunnen spelen in meer kieskeurige reacties. Magnesiumkation vormt oplosbare complexen met dNTP's om het werkelijke substraat te produceren dat het polymerase-enzym herkent.
Gelijke hoeveelheden van alle vier de dNTP's helpen ook om de polymerasefoutenkans te verminderen. Bepaalde additieven zoals betaïne, BSA, detergentia, DMSO, glycerol en pyrofosfatase kunnen ook de enzymspecificiteit of de reactie-efficiëntie beïnvloeden.
05 Type thermocycler
Houd er bij het winkelen voor laboratoriumapparatuur rekening mee dat sommige thermocyclers minder nauwkeurig zijn dan andere bij het handhaven van exacte, gewenste temperaturen.
Dit is een gebied waar goedkoop gaan niet loont op de lange termijn als je geconfronteerd wordt met een kieskeurige reactie of met primers die een smal bereik van de uitgloeitemperatuur vereisen.
Dunwandige reageerbuizen die zijn ontworpen om te passen in het merk thermocycler dat u gebruikt, helpen ook de reactietemperaturen te optimaliseren.
06 Cyclusinstellingen
Verhoogde opbrengst kan worden bereikt door de verlengingstijd ongeveer om de 20 cycli te verhogen, om te compenseren voor minder enzym om meer templaten te amplificeren. Gewoonlijk zijn minder dan 40 cycli voldoende om minder dan 10 templaatmoleculen te amplificeren tot een concentratie die groot genoeg is om te worden bekeken op een met ethidiumbromide gekleurde agarosegel .