De mate van vereiste proteïnezuiverheid hangt af van het beoogde eindgebruik van het eiwit.
Voor sommige toepassingen is een ruw extract voldoende. Voor andere toepassingen, zoals in voedingsmiddelen en farmaceutische producten, is echter een hoog niveau van zuiverheid vereist. Om dit te bereiken worden in een reeks zuiveringsstappen typisch verschillende eiwitzuiveringsmethoden gebruikt.
Elke eiwitzuiveringsstap resulteert gewoonlijk in enige mate van productverlies. Daarom is een ideale strategie voor eiwitzuivering een strategie waarbij het hoogste niveau van zuivering in de minste stappen wordt bereikt. De keuze van de te gebruiken stappen is afhankelijk van de grootte, lading, oplosbaarheid en andere eigenschappen van het doeleiwit. De volgende technieken zijn het meest geschikt voor het zuiveren van een enkel cytosolisch eiwit. Zuivering van cytosolische eiwitcomplexen is gecompliceerder en vereist gewoonlijk dat verschillende methoden worden toegepast.
Eerste stappen voor eiwitzuivering
De eerste stap in het zuiveren van intracellulaire (in de cel) eiwitten is de bereiding van een ruw extract .
Het extract bevat een complex mengsel van alle eiwitten van het cytoplasma van de cel en enkele extra macromoleculen, co-factoren en voedingsstoffen. Het ruwe extract kan voor sommige toepassingen in de biotechnologie worden gebruikt, maar als zuiverheid een probleem is, moeten daaropvolgende zuiveringsstappen worden gevolgd.
Ruwe eiwitextracten worden bereid door celafval te verwijderen dat is gegenereerd door cellysis, dat wordt bereikt met behulp van chemicaliën en enzymen , ultrasoonapparaat of een Franse pers. Het afval wordt verwijderd door centrifugatie en het supernatant wordt gewonnen. Ruwe preparaten van extracellulaire eiwitten kunnen worden verkregen door eenvoudig de cellen te verwijderen door centrifugatie.
Voor bepaalde biotechnologische toepassingen is er vraag naar thermostabiele enzymen : enzymen die hoge temperaturen kunnen verdragen zonder denaturering, en met behoud van een hoge specifieke activiteit. Organismen die deze produceren worden soms extremofielen genoemd. Een gemakkelijke benadering voor het zuiveren van een hittebestendig eiwit is om de andere eiwitten in het mengsel te denatureren door de oplossing te verwarmen en vervolgens te koelen (waardoor het thermostabiele enzym zo nodig kan worden hervormd of opnieuw kan worden opgelost) .De gedenatureerde eiwitten kunnen vervolgens worden verwijderd door centrifugatie.
Tussenliggende zuiveringsstappen
In het verleden was een gebruikelijke tweede stap om een eiwit uit een ruw extract te zuiveren door precipitatie in een oplossing met hoge osmotische sterkte (dwz zoutoplossingen). Nucleïnezuren in het ruwe extract kunnen worden verwijderd door aggregaten te precipiteren die zijn gevormd met streptomycinesulfaat of protaminesulfaat.
Eiwitneerslag wordt meestal gedaan met ammoniumsulfaat als het zout.
Verschillende eiwitten zullen neerslaan in verschillende concentraties ammoniumsulfaat . In het algemeen precipiteren eiwitten met een hoger molecuulgewicht in lagere concentraties ammoniumsulfaat. Zoutneerslag leidt gewoonlijk niet tot een sterk gezuiverd eiwit maar kan helpen bij het elimineren van enkele ongewenste eiwitten in een mengsel en het concentreren van het monster. Zouten in de oplossing worden vervolgens verwijderd door dialyse door poreuze cellulosebuizen, filtratie of gel-uitsluitingschromatografie.
Moderne biotech-protocollen maken vaak gebruik van de vele commercieel beschikbare kits die kant-en-klare oplossingen bieden voor standaardprocedures. Eiwitzuivering wordt vaak uitgevoerd met behulp van filters en geprepareerde gelfiltratiekolommen. Het enige wat u hoeft te doen, is de instructies volgen en het juiste volume van de juiste oplossing toevoegen en de aangegeven tijdsduur afwachten terwijl u het eluent (wat uit het andere uiteinde van de kolom komt) verzamelt in een nieuwe reageerbuis.
- Chromatografische methoden kunnen worden toegepast met werkbankkolommen of geautomatiseerde HPLC-apparatuur. Scheiding door middel van HPLC kan worden uitgevoerd door omgekeerde fase, ionenuitwisseling of grootte-uitsluitingsmethoden en monsters gedetecteerd door diodearray of lasertechnologie.
Eiwitvisualisatie en beoordeling van zuivering
- Omgekeerde fase chromatografie (RPC) scheidt eiwitten op basis van hun relatieve hydrofobiciteit . Deze techniek is zeer selectief maar vereist het gebruik van organische oplosmiddelen. Sommige eiwitten worden permanent gedenatureerd door oplosmiddelen en verliezen functionaliteit tijdens RPC. Daarom wordt deze methode niet aanbevolen voor alle toepassingen, vooral als het nodig is dat het doeleiwit activiteit behoudt.
- Ionenuitwisselingschromatografie verwijst naar de scheiding van eiwitten op basis van lading . Kolommen kunnen worden voorbereid voor anionenuitwisseling of kationuitwisseling. Anion-uitwisselingskolommen bevatten een stationaire fase met een positieve lading die negatief geladen eiwitten aantrekt. Kolonie-uitwisselingskolommen zijn de omgekeerde, negatief geladen kralen die positief geladen eiwitten aantrekken. Elutie van de doeleiwit (ten) wordt uitgevoerd door de pH in de kolom te veranderen, hetgeen resulteert in een verandering of neutralisatie van de geladen functionele groepen van elk eiwit.
- Grootte-uitsluitingschromatografie ( gelfiltratie ) scheidt grotere eiwitten van kleine eiwitten omdat de grotere moleculen sneller door het verknoopte polymeer in de chromatografiekolom bewegen. De grote eiwitten passen niet in de poriën van het polymeer, terwijl kleinere eiwitten dat wel doen, en het duurt langer om door de chromatografiekolom te reizen, via hun minder directe route. Eluaat wordt verzameld in een reeks buizen die eiwitten scheiden op basis van de elutietijd. Gelfiltratie is een nuttig hulpmiddel voor het concentreren van een eiwitmonster omdat het doeleiwit wordt verzameld in een kleiner elutievolume dan aanvankelijk aan de kolom was toegevoegd. Soortgelijke filtratietechnieken kunnen worden gebruikt tijdens grootschalige eiwitproductie vanwege hun kosteneffectiviteit.
- Affiniteitschromatografie is een zeer bruikbare techniek voor het "polijsten" of het voltooien van het eiwitzuiveringsproces. Kralen in de chromatografiekolom zijn verknoopt met liganden die specifiek aan het doeleiwit binden. Het eiwit wordt vervolgens uit de kolom verwijderd door spoelen met een oplossing die vrije liganden bevat. Deze methode geeft de zuiverste resultaten en de hoogste specifieke activiteit in vergelijking met andere technieken.
- SDS-PAGE is polyacrylamidegelelektroforese, uitgevoerd in aanwezigheid van SDS (natriumdodecylsulfaat) dat aan eiwitten bindt, waardoor ze een grote netto negatieve lading hebben. Omdat de ladingen van alle eiwitten redelijk gelijk zijn, scheidt deze methode ze bijna volledig op basis van de grootte. SDS-PAGE wordt vaak gebruikt om de zuiverheid van eiwitten na elke stap in een reeks te testen. Omdat ongewenste eiwitten geleidelijk uit het mengsel worden verwijderd, wordt het aantal banden zichtbaar op de SDS-PAGE-gel verminderd, totdat er slechts één band is die het gewenste eiwit vertegenwoordigt.
- Immunoblotting is een eiwitvisualisatietechniek die wordt toegepast in combinatie met affiniteitschromatografie. Antilichamen voor een specifiek eiwit worden gebruikt als liganden op een affiniteitschromatografiekolom. Het doeleiwit wordt op de kolom achtergehouden en vervolgens verwijderd door de kolom met een zoutoplossing of andere middelen te spoelen. Antilichamen gekoppeld aan radioactieve of kleurstoflabels helpen bij de detectie van het doeleiwit als het eenmaal is gescheiden van de rest van het mengsel.
bronnen:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, VS.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, VS. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.